首先將高壓蒸汽滅菌器內層滅菌桶取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免妨礙蒸汽流通而影響滅菌效果。高壓蒸汽滅菌器三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。
高壓蒸汽滅菌器加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內層滅菌桶的排氣槽內。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。
高壓蒸汽滅菌器用電爐或煤氣加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內的冷空氣。待冷空氣*排盡后，關上排氣閥，讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當高壓蒸汽滅菌器鍋內壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。本實驗用 1.05kg/cm2，121.3℃，20分鐘滅菌。
高壓蒸汽滅菌器滅菌所需時間到后，切斷電源或關閉煤氣，讓滅菌鍋內溫度自然下降，當壓力表的壓力降至0時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。如果高壓蒸汽滅菌器壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養基由于內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養基而發生污染。將取出的滅菌培養基放入 37℃溫箱培養24小時，經檢查若無雜菌生長，即可待用。
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