毛細管區帶電泳（CZE）對單克隆抗體的電荷異質性分析
毛細管區帶電泳（cze）對單克隆抗體的電荷異質性分析
前言
電荷異質性分析對于單克隆抗體的表征是非常重要的，因為它可提供有關產品的質量和穩定性的重要信息。異質性可源于分子層面的改變，如c-末端賴氨酸修飾、脫酰胺化和翻譯后修飾。毛細管等電聚焦（cief）是一種可以根據蛋白各亞型等電點的變化分離電荷異構體的方法。毛細管等電聚焦（cief）需要在涂層毛細管中進行電泳分離，涂層毛細管可以抑制電滲流（eof）并且可以防止蛋白在管壁表面的吸附，但需要較長的分析時間周期和復雜的樣品制備。
本文展示了通過使用一個簡單的分離緩沖體系和非涂層毛細管，可以在12分鐘內對單克隆抗體的電荷異質性進行分析，得到高分辨率和高重現性的分離結果。在本研究中，使用有效長度為20 cm的短毛細管即可獲得較高分辨率，若使用有效長度為40 cm的毛細管還可以揭示單克隆抗體的更精細的結構。
實驗條件
毛細管區帶電泳
分離緩沖液的配制：0.05% hpmc , 380 mm eaca, 1.9 mm teta
400 mm eaca + 2 mm teta（ph =5.7）緩沖液的配制
在含有95 ml去離子水的100 ml燒杯中加入5.25 g的eaca（sigma, cat. no. a-7824）和30 μlteta（三乙烯四胺，sigma, cat. no. 90460）。充分溶解后，用冰醋酸調節ph至5.7±0.05。將上述溶液轉移至100 ml容量瓶中，并用去離子水定容。所得溶液用0.2 μm 濾膜過濾。
1% hpmc溶液的配制
將1g hpmc（sigma, cat. no. h-7509）加入到含有100 ml去離子水的燒杯中，室溫過夜使其充分溶解。
分離緩沖液的配制
移取400 mm eaca + 2 mm teta（ph = 5.7）緩沖液8.55 ml至 15 ml離心管中，加入1% hpmc溶液450 μl，充分混合。每次使用前新鮮配制。這里準備的分離緩沖液量足夠運行9次分離。
毛細管沖洗液
0.1 n hcl 溶液（fluka, part no. 94015）。
樣品
單克隆抗體x是一種具有代表性的治療性單克隆抗體。原液為20 mg/ ml的單抗x，用去離子水稀釋至1mg/ml，并用于毛細管等電聚焦（cief）和毛細管區帶電泳（cze）的分離。
毛細
管規格：熔融石英，50 μm內徑，360 μm外徑。用于高分辨率分離方法的毛細管總長度為50 cm，有效長度為40 cm；用于快速分離方法的毛細管總長度為30 cm，有效長度為20 cm。
儀器
本次實驗使用的儀器是pa 800 plus生物制藥分析系統配備uv或pda檢測器。使用uv檢測器時，在毛細管區帶電泳（cze）實驗中配置214 nm的濾光片并且數據采集頻率設置為4 hz，而在毛細管等電聚焦（cief）實驗中配置280 nm的濾光片。pda檢測器則用于重復毛細管區帶電泳（cze）實驗用于之后和uv/vis的數據進行比較。樣品儲藏溫度和卡盒的溫度分別為20 ℃和25 ℃。
毛細管區帶電泳（cze）方法
結果與討論
分別運用毛細管等電聚焦（cief）和毛細管區帶電泳（cze）的方法對單克隆抗體x電荷異質性進行了分析。典型單克隆抗體x等電聚焦的分離說明其具有復雜的電荷異構體，等電點范圍從pi 6.3到pi 6.91（圖1）。在ph = 5.7的緩沖體系下，由于可能存在潛在蛋白溶解度問題1，我們并不能確認使用毛細管區帶電泳（cze）分離是否能夠對此樣品進行有效的分離。然而，實驗結果表明，雖然該單克隆抗體是弱酸性的，且其等電點與分離緩沖液的ph值相差不到1個ph單位，但毛細管區帶電泳（cze）方法在12分鐘內就可以獲得*的高分辨的分離（圖2）。
圖1. 單克隆抗體x的毛細管等電聚焦（cief）電泳圖，單克隆抗體的濃度為1 mg/ml
圖2. 單克隆抗體x在毛細管區帶電泳（cze）條件下的電泳圖和積分。電荷異構峰分別歸類為堿性峰，主峰和酸性峰。毛細管區帶電泳（cze）條件：單克隆抗體x 1 mg/ml；分離緩沖液：0.05% hpmc，380 mm eaca（*），1.9 mm teta；熔融石英毛細管，30 kv分離電壓。
結果表明，毛細管區帶電泳（cze）的分離方法可以實現高分辨率的分離（圖3）。此外，在堿性峰區域的分辨率優于毛細管等電聚焦（cief）。毛細管區帶電泳（cze）的一個重要的優勢是不僅僅分辨率高，而且分析速度快。得到完整的電荷異質性分離分析，毛細管區帶電泳（cze）只需要12分鐘而毛細管等電聚焦（cief）則需要23分鐘。
實驗的重復性是十分重要的，在這里進行了連續多次的毛細管區帶電泳（cze）運行來說明其分離重現性（圖4）。按照圖2的方式對這些數據進行積分（圖5），得到堿性峰、主峰和酸性峰群。連續多針運行結果表明毛細管區帶電泳（cze）分離具有杰出的重現性，其酸性峰、主峰和堿性峰的校正峰面積rsd小于3%，遷移時間rsd小于0.55%（表1）。
表1. 毛細管區帶電泳（cze）分析單克隆抗體x的原始數據。堿性、中性和酸性樣品峰的矯正峰面積和遷移時間的重現性
圖3. 單克隆抗體x的毛細管等電聚焦（cief）和毛細管區帶電泳（cze）分析方法對比
圖4. 單克隆抗體x的毛細管區帶電泳（cze）分離。9針連續的分離均使用uv檢測器。單克隆抗體x的濃度為1 mg/ml；緩沖液：0.05% hpmc，380 mm eaca，1.9 mm teta；熔融石英毛細管，30 kv分離電壓
圖5. 分析單克隆抗體x 的32 karat軟件積分參數
毛細管區帶電泳（cze）還具有很大的靈活性，不同檢測器的類型都能提供相同的性能。使用毛細管區帶電泳（cze）的方法無論配置二極管陣列檢測器或是紫外檢測器對單抗x進行分離都可以獲得相同的分辨率。此外，使用這兩種檢測器還可得到相同的組分面積百分比（圖6）。
若希望獲得更高的分辨率，可通過增加毛細管的有效長度，能得到比快速分離的方法更精細的分離。如圖7所示，使用有效長度為40 cm的毛細管對單克隆抗體x進行分離，盡管總分離時間有所增加，但高分辨率有了明顯的提高。
更高的分辨率有利于對單克隆抗體x的降解狀態（如暴露在60 ℃48個小時）進行分析。然而，只有增加毛細管的有效長度，才有可能看到因為熱不穩定性形成的酸性峰和堿性峰的精細結構。
圖6. 使用uv和pda檢測器進行毛細管區帶電泳（cze）分離的對比。uv檢測器（紅色），pda檢測器（黑色）。分離條件均如圖1所述
圖7. 不同毛細管有效長度的結果對比。毛細管區帶電泳（cze）分離條件如前所述。40 cm有效長度（下圖），20 cm有效長度（插圖）
圖8. 單克隆抗體x在高溫下（60℃）暴露5天降解后的分析。分別使用40 cm毛細管有效長度（下圖）和20 cm毛細管有效長度（插圖）進行毛細管區帶電泳（cze）的分離
結論
使用毛細管區帶電泳（cze）和毛細管等電聚焦（cief）的方法都可以很容易的檢測蛋白質電荷異質性。毛細管等電聚焦（cief）通常用于獲得電荷異質性和等電點的信息，而本文介紹的毛細管區帶電泳（cze）方法具有對典型單克隆抗體快速及高重現性分離的能力。該毛細管區帶電泳（cze）方法可以通過增加毛細管的有效長度進行提高峰分辨率的優化。毛細管區帶電泳（cze）分離的性能不受檢測器的影響，毛細管區帶電泳（cze）可以在堿性峰、主峰和酸性峰分離中表現出很好的重現性。基于上述優勢可見，毛細管區帶電泳（cze）是一種可以替代毛細管等電聚焦（cief）的快速分析方法，在保證分離效果和重現性的同時，為高通量分析提供了可能。
references
1. yan he, colleen isele, weiying hou, margaret ruesch. 2011. rapid analysis of charge variants of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in dynamically coated fused-silica capillary. journal of separation science, vol. 34: pages 548-555.
2. ingrid d. cruzado-park, scott mack and chitra k. ratnayake, a robust cief method: intermediate precision for the ph 5-7 range, pn a-12015
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本文展示了通過使用一個簡單的分離緩沖體系和非涂層毛細管，可以在12分鐘內對單克隆抗體的電荷異質性進行分析，得到高分辨率和高重現性的分離結果。在本研究中，使用有效長度為20 cm的短毛細管即可獲得較高分辨率，若使用有效長度為40 cm的毛細管還可以揭示單克隆抗體的更精細的結構。
實驗條件
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樣品
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儀器
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圖1. 單克隆抗體x的毛細管等電聚焦（cief）電泳圖，單克隆抗體的濃度為1 mg/ml
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圖7. 不同毛細管有效長度的結果對比。毛細管區帶電泳（cze）分離條件如前所述。40 cm有效長度（下圖），20 cm有效長度（插圖）
圖8. 單克隆抗體x在高溫下（60℃）暴露5天降解后的分析。分別使用40 cm毛細管有效長度（下圖）和20 cm毛細管有效長度（插圖）進行毛細管區帶電泳（cze）的分離
結論
使用毛細管區帶電泳（cze）和毛細管等電聚焦（cief）的方法都可以很容易的檢測蛋白質電荷異質性。毛細管等電聚焦（cief）通常用于獲得電荷異質性和等電點的信息，而本文介紹的毛細管區帶電泳（cze）方法具有對典型單克隆抗體快速及高重現性分離的能力。該毛細管區帶電泳（cze）方法可以通過增加毛細管的有效長度進行提高峰分辨率的優化。毛細管區帶電泳（cze）分離的性能不受檢測器的影響，毛細管區帶電泳（cze）可以在堿性峰、主峰和酸性峰分離中表現出很好的重現性。基于上述優勢可見，毛細管區帶電泳（cze）是一種可以替代毛細管等電聚焦（cief）的快速分析方法，在保證分離效果和重現性的同時，為高通量分析提供了可能。
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